Rheoliad 21
1. Rhaid dechrau'r profion pan ddaw'r sampl i law neu ar y diwrnod gwaith cyntaf sy'n caniatáu i'r dull hwn gael ei gwblhau. Os na ddechreuir y prawf ar y diwrnod y daw'r sampl i law rhaid ei storio mewn oergell rhwng 2°C ac 8°C nes bydd ei hangen. Os cafodd y sampl ei rhoi mewn oergell, rhaid ei thynnu o'r oergell a'i storio ar wres ystafell am o leiaf un awr cyn i'r prawf ddechrau.
2. Rhaid cyflawni'r profion drwy ddefnyddio dwy gyfran 10 gram o bob sampl a gyflwynir i'w phrofi. Rhaid i bob sampl 10 gram gael ei rhoi'n aseptigol mewn cynhwysydd sterilaidd sy'n cynnwys 90 ml Clostridium perfringens o wanedydd a wnaed o 0.1% pepton a 0.8% sodiwm clorid wrth pH o 7 a'i chymysgu'n drwyadl nes bod y sampl mewn daliant gwastad.
3. Am bob cyfran o'r sampl rhaid trosglwyddo 1 ml o'r hydoddiant i ddysgl petri 90 mm sterilaidd (yn ddyblyg) y mae'n rhaid ychwanegu ynddi 15 ml o agar Shahidi-Ferguson (agar SF)(1) ar dymheredd o 47°C±1°C a'i gymysgu ar unwaith a chan bwyll drwy droelli'r ddysgl 5 gwaith yn glocwedd a 5 gwaith yn wrthglocwedd.
4. Pan fydd yr agar wedi ceulo, rhaid troshaenu pob plât agar â 10 ml pellach o agar SF ar dymheredd o 47°C±1°C. Pan fydd y droshaen wedi ceulo a chyda'r platiau at i fyny, rhaid deor y platiau'n anerobig ar 37°C±1°C am 20 awr±2 awr.
5. Ar ôl y deoriad rhaid archwilio pob set o blatiau dyblyg am gytrefi nodweddiadol o Clostridium perfringens (du). Bydd y sampl yn methu dros dro os bydd unrhyw gytrefi sy'n nodweddiadol o Clostridium perfringens yn bresennol, ac yn yr achos hwnnw rhaid dilyn y weithdrefn ganlynol er mwyn cadarnhau ai cytrefi o Clostridium perfringens ydynt ai peidio.
6. Yn achos pob plât, rhaid is-feithrin 10 cytref nodweddiadol o Clostridium perfringens ar blât agar SF pellach. Os bydd llai na 10 cytref ar y plât, rhaid is-feithrin pob cytref nodweddiadol ar blât pellach. Rhaid deor y platiau'n anerobig ar 37°C±1°C am 20 awr±2 awr.
7. Os oes gordyfiant ar arwynebedd y platiau ac nad yw'n bosibl dethol cytrefi nodweddiadol a ynyswyd yn dda, rhaid is-feithrin 10 cytref a amheuir ar ddyblygiadau o blatiau agar SF a'u deor yn anerobig ar 37°C±1°C am 20 awr±2 awr.
8. Rhaid is-feithrin un gytref nodweddiadol o bob plât ar yr agar SF a'i deor yn anerobig ar 37°C±1°C am 20 awr±2 awr.
9. Ar ôl y deoriad rhaid archwilio pob plât am gytrefi sy'n nodweddiadol o Clostridium perfringens. Rhaid i bob cytref sy'n nodweddiadol o Clostridium perfringens–
(a)gael trywanblaniad i gyfrwng symudoldeb nitrad(2); a
(b)ei phlannu naill ai mewn cyfrwng gelatin lactos(3) neu mewn disgiau gelatin golosg(4);
a'u deor yn anerobig ar 37°C±1°C am 20 awr±2 awr.
10. Rhaid archwilio'r cyfrwng symudoldeb nitrad am y math o dyfiant ar hyd y llinell drywanu. Os oes tystiolaeth o dyfiant yn tryledu i mewn i'r cyfrwng oddi wrth y llinell drywanu, rhaid ystyried bod y bacteria yn symudol.
11. Ar ôl archwilio'r cyfrwng symudoldeb nitrad, rhaid ychwanegu ato 0.2 ml i 0.5 ml o adweithydd canfod nitrid. Bydd lliw coch yn ymffurfio yn cadarnhau bod y bacteria wedi rhydwytho nitrad i nitrid. Rhaid diystyru meithriniadau sy'n dangos adwaith wan (h.y. lliw pinc). Os na fydd lliw coch yn ymffurfio cyn pen 15 munud, rhaid ychwanegu swm bach o lwch zinc a gadael i'r plât sefyll am 15 munud. Os bydd lliw coch yn ymffurfio ar ôl ychwanegu llwch zinc, bydd hyn yn cadarnhau nad yw nitrad wedi'i rydwytho'n nitrid.
12. Rhaid archwilio'r cyfrwng gelatin lactos am bresenoldeb swigod bach nwy yn y cyfrwng.
13. Rhaid archwilio'r cyfrwng gelatin lactos am liw. Mae lliw melyn yn dangos bod y lactos wedi eplesu.
14. Rhaid oeri'r cyfrwng gelatin lactos am un awr ar 2- 8°C ac yna'i wirio i weld a yw'r gelatin wedi hylifo. Os yw'r cyfrwng wedi ymsolido, rhaid ei ailddeor yn anerobig am 18- 24 awr eto, oeri'r cyfrwng am un awr eto ar 2- 8°C a'i wirio eto i weld a yw'r gelatin wedi hylifo.
15. Rhaid penderfynu ar bresenoldeb Clostridium perfringens ar sail y canlyniadau o baragraffau 10 i 14. Rhaid ystyried bod bacteria sy'n cynhyrchu cytrefi duon ar agar SF, yn ansymudol, yn rhydwytho nitrad yn nitrid, yn cynhyrchu nwy ac asid o lactos ac yn hylifo gelatin o fewn 48 awr yn Clostridium perfringens.
16. Rhaid cynnal profion rheoli bob dydd wrth ddechrau profi gan ddefnyddio–
(a)Clostridium perfringens heb fod yn fwy na saith niwrnod oed ar adeg ei ddefnyddio;
(b)Escherichia coli NCTC 10418((5) neu sylwedd cyfwerth iddo nad yw'n fwy na saith niwrnod oed ar adeg ei ddefnyddio; ac
(c)protein anifeiliaid neu gompost neu weddill traul wedi'i brosesu sy'n rhydd rhag Clostridium perfringens.
17. Rhaid rhoi darnau 10 gram o brotein anifail wedi'i rendro yn aseptigol yn y naill a'r llall o ddau gynhwysydd sterilaidd sy'n cynnwys 90 ml o Ddŵ r Pepton Byfferog (BPW)(6) a'i gymysgu'n drwyadl nes bod y samplau mewn daliant gwastad.
18. Rhaid rhoi un gytref o Clostridium perfringens mewn 10 ml BPW a'i chymysgu i ffurfio daliant gwastad. Rhaid ychwanegu 0.1 ml o'r daliad at y daliad yn y paragraff blaenorol. Rhaid ailadrodd hyn ar gyfer Escherichia coli.
19. Yna caiff y rhain eu trin a'u harchwilio yn yr un modd â'r samplau prawf. Os na ffurfir cytrefi nodweddiadol yna rhaid bod profion y diwrnod hwnnw'n annilys a rhaid eu hailadrodd.
1.—(1) Rhaid dechrau'r profion pan ddaw'r sampl i law neu ar y diwrnod gwaith cyntaf sy'n caniatáu i'r dull hwn gael ei gwblhau. Os na ddechreuir y prawf ar y diwrnod y daw'r sampl i law rhaid ei storio mewn oergell hyd nes y bydd ei hangen. Os cafodd y sampl ei rhoi mewn oergell rhaid ei thynnu o'r oergell a'i storio ar wres ystafell am o leiaf bedair awr cyn i'r prawf ddechrau.
(2) Rhaid gweithredu'r profion yn ddyblyg gan ddefnyddio dwy gyfran 25 gram yr un o bob sampl a anfonwyd i'w phrofi.
2. Ar y diwrnod cyntaf, rhaid rhoi'r ddwy sampl 25 gram yn aseptigol mewn cynhwysydd sterilaidd sy'n cynnwys 225 ml o Ddwr Pepton Byfferog (BPW) a'u deor ar 37°C±1°C am 18 awr±2 awr.
3. Ar yr ail ddiwrnod, rhaid plannu 0.1 ml o'r cynhwysydd BPW wedi'i ddeor mewn 10 ml o gawl Rappaports Vassiliadis (cawl RV)(7) a'i ddeor ar 41.5°C±0.5°C am 24 awr ±3awr.
4. Ar y trydydd diwrnod, rhaid gosod y cawl RV ar ddau blât 90 milimetr o Agar Gwyrdd Gloyw (BGA)(8) neu ar un plât 90 milimetr o BGA ac un plât 90 milimetr o Agar Sylos Lysin Deocsicolad (XLD)(9) gan ddefnyddio dolen 2.5 mm mewn diamedr. Rhaid plannu defnyn yn y platiau sydd wedi'i gymryd o ymyl wyneb yr hylif drwy dynnu'r ddolen dros y cyfan o un plât mewn patrwm igam-ogam gan fynd ymlaen i'r ail blât heb aildrydanu'r ddolen. Rhaid i'r bwlch rhwng llinellau'r ddolen fod yn 0.5 cm- 1.0 cm. Rhaid deor y platiau ar 37°C ±2°C dros nos am 24 ± 3 awr. Rhaid ailddeor y cawl RV gweddilliol ar 41.5°C±0.5°C am 24 awr ychwanegol.
5. The residual RV broth must be reincubated at 41.5°C±0.5°C for a further 24 hours.
6. Ar y pedwerydd diwrnod, rhaid archwilio'r platiau a rhaid is-feithrin lleiafswm o dair cytref o bob plât sy'n dangos amheuaeth o dyfiant Salmonela–
(a)ar blât agar gwaed;
(b)ar blât agar MacConkey(10); ac
(c)i gyfrwng biocemegol sy'n addas i adnabod Salmonela.
7. Rhaid i'r cawl RV a ailddeorwyd gael ei osod ar blatiau fel a ddisgrifir ym mharagraff 4.
8. Ar y pumed diwrnod, rhaid i'r cyfrwng cyfansawdd wedi'i ddeor neu'r hyn sy'n gyfwerth iddo gael ei archwilio a rhaid cofnodi'r canlyniadau, gan ddiystyru'r meithriniadau y mae'n amlwg nad ydynt yn rhai Salmonela. Rhaid cyflawni profion sleidiau serolegol sy'n defnyddio Salmonela amryfalent “O”ac amryfalent “H” (cyfnod 1 a 2) sera cyflynedig ar gytrefi detholedig a amheuir ac a gasglwyd o blatiau agar gwaed neu blatiau MacConkey. Os bydd adweithiau gyda un o'r sera neu yn y ddau rhaid dosbarthu'r cytrefi drwy seroleg sleidiau. Os gofynnir iddo'n ysgrifenedig gan y Cynulliad Cenedlaethol, rhaid i weithredydd y labordy anfon is-feithriniad at un o Labordai Milfeddygol Rhanbarthol Asiantaeth Labordai Milfeddygol yr Adran dros yr Amgylchedd, Bwyd a Materion Gwledig ar gyfer dosbarthu ymhellach.
9. Rhaid archwilio'r platiau y cyfeirir atynt ym mharagraff 7 a chymryd camau pellach yn ôl paragraff 6 ac 8.
10. Rhaid dechrau'r profion pan ddaw'r sampl i law neu ar y diwrnod gwaith cyntaf sy'n caniatáu i'r dull hwn gael ei gwblhau. Os na ddechreuir y prawf ar ddiwrnod cael y sampl rhaid ei storio mewn oergell hyd nes y bydd ei hangen. Os cafodd y sampl ei rhoi mewn oergell rhaid ei thynnu o'r oergell a'i storio ar wres ystafell am o leiaf bedair awr cyn i'r prawf ddechrau.
11. Ar y diwrnod cyntaf rhaid gweithredu'r profion yn ddyblyg drwy ddefnyddio dwy gyfran 25 gram o bob sampl a gyflwynir i'w phrofi. Rhaid rhoi'r ddwy sampl 25 gram yn aseptigol mewn cynhwysydd sterilaidd sy'n cynnwys 225 ml o Ddŵr Pepton/Lysin/Glwcos Byfferog (BPW/L/G)(11) a'u deor ar 37°C am 18 awr.
12. Ar yr ail ddiwrnod rhaid ychwanegu'r BPW/L/G a ddeorwyd at gyfrwng Dwlsitol Selenit Cystin Trimethylamin-N-Ocsid (SC/T/D)(12) a Glwcos Lysin Decarbocsylas (LD/G)(13) mewn celloedd neu bantiau dargludo trydanol. Ar gyfer celloedd neu bantiau sy'n cynnwys cyfrwng mwy na 5 ml rhaid ychwanegu 0.2 ml o BPW/L/G ac ar gyfer celloedd neu bantiau sy'n cynnwys cyfrwng 5 ml neu lai rhaid ychwanegu 0.1 ml o BPW/L/G. Rhaid bod y celloedd neu'r pantiau wedi'u cysylltu â chyfarpar mesur dargludiant trydanol addas a osodwyd i fonitro a chofnodi newidiadau yn y dargludiant trydanol fesul 6 munud dros gyfnod o 24 awr. Rhaid cadw tymheredd y celloedd a'r pantiau ar 37°C.
13. Ar y trydydd diwrnod, ar ddiwedd y cyfnod 24 awr, rhaid i'r wybodaeth a gofnodwyd gan y cyfarpar mesur dargludiant gael ei dadansoddi a'i dehongli gan ddefnyddio'r meini prawf a ddiffinnir gan weithgynhyrchwyr y cyfarpar. Os dynodir dros dro bod pant neu gell yn cadarnhau bod Salmonela'n bresennol, rhaid cadarnhau'r canlyniad drwy is-feithrin cynnwys y pant neu'r gell ar ddau blât 90 milimetr o BGA neu ar un plât 90 milimetr o BGA ac un plât 90 milimetr o Agar Sylos Lysin Deocsicolad (XLD) sy'n defnyddio dolen 2.5 mm ei diamedr. Rhaid plannu defnyn yn y platiau sydd wedi'i gymryd o ymyl wyneb yr hylif drwy dynnu'r ddolen dros y cyfan o'r naill blât mewn patrwm igam-ogam gan fynd ymlaen i'r plât arall heb ailwefru'r ddolen. Rhaid i'r bwlch rhwng llinellau'r ddolen fod yn 0.5 cm- 1.0 cm. Rhaid deor y platiau ar 37°C dros nos.
14. Ar y pedwerydd diwrnod, rhaid archwilio'r platiau a rhaid is-feithrin lleiafswm o 3 cytref o bob plât sy'n dangos amheuaeth o dyfiant Salmonela–
(a)ar blât agar gwaed;
(b)ar blât agar MacConkey; ac
(c)i gyfrwng biocemegol sy'n addas i adnabod Salmonela.
Rhaid deor y cyfryngau hyn ar 37°C dros nos.
15. ar y pumed diwrnod, rhaid i'r cyfrwng cyfansawdd wedi'i ddeor neu'r hyn sy'n gyfwerth iddo gael ei archwilio a rhaid cofnodi'r canlyniadau, gan ddiystyru'r meithriniadau y mae'n amlwg nad ydynt yn rhai Salmonela. Rhaid cyflawni profion sleidiau serolegol sy'n defnyddio Salmonela amryfalent “O”ac amryfalent “H” (cyfnod 1 a 2) sera cyfludol ar gytrefi detholedig a amheuir ac a gasglwyd o blatiau agar gwaed neu blatiau MacConkey. Os bydd adweithiau yn un o'r sera neu yn y ddau rhaid dosbarthu'r cytrefi drwy seroleg sleidiau. Os gofynnir iddo'n ysgrifenedig gan y Cynulliad Cenedlaethol, rhaid i weithredydd y labordy anfon is-feithriniad at un o Labordai Milfeddygol Rhanbarthol Asiantaeth Labordai Milfeddygol yr Adran dros yr Amgylchedd, Bwyd a Materion Gwledig ar gyfer dosbarthu ymhellach.
1. Rhaid dechrau'r profion pan ddaw'r sampl i law neu ar y diwrnod gwaith cyntaf sy'n caniatáu i'r dull hwn gael ei gwblhau. Os na ddechreuir y prawf ar y diwrnod y daw'r sampl i law rhaid ei storio mewn oergell rhwng 2°C a 8°C hyd nes y bydd ei hangen. Os cafodd y sampl ei rhoi mewn oergell rhaid ei thynnu o'r oergell a'i storio ar wres ystafell am o leiaf un awr cyn i'r prawf ddechrau.
2. Rhaid gweithredu'r profion drwy ddefnyddio pum cyfran 10 gram o bob sampl a gyflwynir i'w phrofi. Rhaid rhoi pob sampl 10 gram yn aseptigol mewn cynhwysydd sterilaidd sy'n cynnwys 90 ml o Ddŵ r Pepton Byfferog a'i chymysgu'n drylwyr hyd nes bod y samplau mewn daliant gwastad.
3. Am bob cyfran o'r sampl rhaid trosglwyddo 1 ml o hydoddiant i ddysgl petri 90 mm ddi-haint (yn ddyblyg). Rhaid bod y platiau wedi'u labelu i ddynodi cyfran y sampl y cymerwyd yr hydoddiant ohoni. Rhaid ychwanegu 15 ml o Agar Glwcos Bustl Coch Fioled (VRBGA)(14) ar dymheredd o 47°C±2°C ym mhob dysgl petri ac ar unwaith ei gymysgu gan bwyll drwy droelli'r ddysgl bum gwaith yn glocwedd a phum gwaith yn wrthglocwedd.
4. Unwaith y mae'r agar wedi ceulo, rhaid troshaenu pob plât agar â 10 ml VRBGA pellach o agar ar dymheredd o 47°C±2°C. Pan fydd y droshaen wedi ceulo rhaid troi'r platiau wyneb i waered a'u deor yn anerobig ar 36°C±1°C am 20 awr±2 awr.
5. Ar ôl y deoriad rhaid archwilio pob set o blatiau dyblyg am gytrefi sy'n nodweddu Enterobacteriaceae (cytrefi porffor 1-2 mm eu diamedr). Rhaid cyfrif yr holl gytrefi nodweddiadol ar bob plât a chymryd cymedr rhifyddol y platiau dyblyg.
Bydd y sampl yn methu dros dro naill ai–
(a)os bydd unrhyw gymedr rhifyddol dros 30(15); neu
(b)os bydd tri neu ragor o gymedrau rhifyddol dros 10;
ac yn yr achos hwnnw rhaid dilyn y weithdrefn ganlynol er mwyn cadarnhau a yw'r cytrefi yn Enterobacteriaceae neu beidio.
6. Ar ôl cyfrif y cytrefi, rhaid cymryd cytrefi nodweddiadol ar hap o'r platiau agar, a rhaid i'r nifer fod o leiaf yn ail isradd y cytrefi a gyfrifwyd. Rhaid is-feithrin y cytrefi ar blât agar gwaed a'u deor yn aerobig ar 37°C±1°C am 20 awr±2 awr.
7. Rhaid cyflawni prawf ocsidas a phrawf eplesiad glwcos ar bob un o'r pum cytref a gafodd eu his-feithrin. Rhaid ystyried bod cytrefi sy'n ocsidas-negyddol ac yn eplesiad glwcos-cadarnhaol yn Enterobacteriaceae.
8. Os na phrofir bod yr holl gytrefi yn Enterobacteriaceae, rhaid i'r cyfanswm cyfrif ym mharagraff 5 gael ei leihau yn gymesur cyn cadarnhau a ddylai'r sampl fethu neu beidio.
9. Rhaid cynnal profion rheoli bob dydd wrth ddechrau profi gan ddefnyddio–
(a)Escherichia coli NCTC 10418 heb fod yn fwy na saith niwrnod oed ar adeg ei ddefnyddio; ac
(b)protein anifeiliaid neu gompost neu weddill traul wedi'i brosesu sy'n rhydd rhag Enterobacteriaceae.
10. Rhaid rhoi cyfran 10 gram o'r protein anifail wedi'i rendro yn aseptigol mewn cynhwysydd sterilaidd sy'n cynnwys 90 ml BPW a'i gymysgu'n drwyadl nes bod y sampl mewn daliant gwastad.
11. Rhaid rhoi un gytref o Escherichia coli mewn 10 ml BPW a'i gymysgu i ffurfio daliant gwastad. Rhaid ychwanegu 0.1 ml o'r daliad at y daliad yn y paragraff blaenorol.
12. Yna caiff hon ei thrin a'i harchwilio yn yr un modd â'r samplau prawf. Os na ffurfir cytrefi nodweddiadol yna rhaid bod profion y diwrnod hwnnw'n annilys a rhaid eu hailadrodd.
Shahidi-Ferguson Agar – Gweler Shahidi, S.A. a Ferguson, A.R. (1971) Applied Microbiology 21:500-506. American Society for Microbiology, 1913 1 St N.W., Washington DC 20006, UDA.
Motility nitrate medium – Gweler Hauschild AHW, Gilbert RJ, Harmon SM, O"Keefe MF, Vahlefeld R, (1997) ICMSF Methods Study VIII, Canadian Journal of Microbiology 23, 884-892. National Research Council of Canada, Ottawa ON K1A OR6, Canada.
Lactos gelatin medium – Gweler Hauschild AHW, Gilbert RJ, Harmon SM, O"Keefe MF, Vahlefield R, (1997) ICMSF Methods Study VIII, Canadian Journal of Microbiology 23, 884-892.
Charcoal gelatin discs -Gweler Mackie a McCartney, (1996) Practical Medical Microbiology 14, 509. Churchill Livingstone, Robert Stevenson House, 1-3 Baxter"s Place, Leith Walk, Caeredin EH1 3AF.
The National Collection of Type Cultures, Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Ave, Llundain NW9 5HT.
Buffered Pepton Water – Gweler Edel, W. and Kampelmacher, E.H. (1973) Bulletin of World Health Organisation, 48: 167-174, World Health Organisation Distribution and Sales, CH-1211, Genefa 27, Y Swistir (ISSN 0042-9686).
Rappaports Vassiliadis Broth – Gweler Vassiliadis P, Pateraki E, Papaiconomou N, Papadkis J A, a Trichopoulos D (1976) Annales de Microbiologie (Institute Pasteur) 127B: 195-200. Elsevier, 23 rue Linois, 75724 Paris, Cedex 15, Ffrainc.
Brilliant Green Agar – Gweler Edel W and Kampelmacher E H (1969) Bulletin of World Health Organisation 41:297-306, World Health Organisation Distribution and Sales, CH-1211, Genefa 27, Y Swistir (ISSN 0042-9686).
Xylose Lisene Deoxycholate Agar – Gweler Taylor W I, (1965) American Journal of Clinical Pathology, 44:471-475, Lippincott and Raven, 227E Washington Street, Philadelphia PA 19106, UDA.
MacConkey Agar – Gweler (1963) International Standards for Drinking Water, World Health Distribution and Sales, CH-1211, Genefa 27, Y Swistir.
Buffered Peptone Water/Lysine/Glucose – Gweler Ogden I D (1988) International Journal of Food Microbiology 7:287-297, Elsevier Science BV, PO Box 211, 1000 AE, Amsterdam, Yr Iseldiroedd (ISSN 0168-1695).
Selenite Cystine Trimethylamine-N-Oxide Dulcitol – Gweler Easter, M C and Gibson, D M, (1985) Journal of Hygiene 94:245-262, Cambridge University Press, Caer-grawnt
Lysine Decarboxylase Glucose – Gweler Ogden I D (1988) International Journal of Food Microbilogy 7:287-297, Elsevier Science BV, PO Box 211, 1000 AE, Amsterdam, Yr Iseldiroedd (ISSN 0168-1695).
Violet Red Bile Glucose Agar – Gweler Mossell D A A, Eelderink I, Koopmans M, van Rossem F (1978) Laboratory Practice 27 No. 12 1049-1050; Emap Maclaren, PO Box 109, Maclaren House, 19 Scarbrook Road, Croydon CR9 1QH.
Mae cymedr rhifyddol yn gyfwerth â 3x10 197 o unedau ffurfio cytref fesul gram o"r sampl wreiddiol.